实时荧光定量PCR分析仪

实时荧光定量ＰＣＲ分析仪

定义
实时荧光定量ＰＣＲ（Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ　Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ　ＰＣＲ，ｑＰＣＲ）分析仪是一种用于在ＤＮＡ扩增过程中实时监测荧光信号的高精度分子生物学仪器。它结合了传统ＰＣＲ的核酸扩增能力与荧光检测技术，可对起始模板ＤＮＡ／ＲＮＡ进行精确定量、基因表达分析、病原体检测等，是分子诊断、基因研究的核心设备。

核心工作原理

1. ＰＣＲ扩增基础

• 通过温度循环（变性→退火→延伸）在体外指数级扩增特定ＤＮＡ片段。

2. 荧光标记与检测

• 荧光探针／染料：在反应体系中加入荧光标记物（如ＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ、ＴａｑＭａｎ探针），其荧光强度与ＰＣＲ产物量成正比。

• 实时监测：每完成一次扩增循环，仪器通过光学系统检测荧光信号，生成扩增曲线。

3. 定量原理

• Ｃｔ值（循环阈值）：荧光信号达到设定阈值时的循环数。Ｃｔ值与起始模板量成反比（模板越多，Ｃｔ值越小）。

• 标准曲线法：通过已知浓度的标准品建立Ｃｔ值－浓度对数曲线，计算未知样本浓度。

仪器核心结构

关键技术类型

1. 荧光化学方法

• 茎环结构探针，仅与靶序列结合时发荧光，背景噪音低。

• 探针含报告／淬灭基团，扩增时水解释放荧光，特异性极高。

• 结合双链ＤＮＡ发荧光，成本低，但可能结合非特异产物（需熔解曲线验证）。

• ＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ　Ｉ：

• 水解探针（ＴａｑＭａｎ）：

• 分子信标（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｅａｃｏｎ）：

2. 多重检测能力

• 多色荧光通道可同时检测多个靶基因（如病原体分型、内参基因校正）。

核心应用领域

操作流程

1. 样本准备：提取ＤＮＡ／ＲＮＡ　→　逆转录（ＲＮＡ样本）。

2. 反应体系配制：引物／探针、荧光染料、模板、聚合酶混合。

3. 程序设置：

• 预变性（９５℃，　３０ｓ）→　循环扩增（９５℃变性，　５ｓ　→　６０℃退火／延伸，　３０ｓ，　４０次）→　熔解曲线分析（６０℃→９５℃）。

4. 数据分析：

• 软件自动生成扩增曲线、熔解曲线、标准曲线，计算基因相对表达量（２＜ｓｕｐ＞－ΔΔＣｔ＜／ｓｕｐ＞）。

优势与局限

关键性能参数

• 温控精度：±０．１℃（确保扩增特异性）。

• 检测通道数：决定多重检测能力（常见４－６通道）。

• 升降温速率：＞５℃／秒可缩短反应时间。

• 灵敏度：可检测低**１－１０拷贝的模板。

• 通量：９６孔板（中通量）ｖｓ．　３８４孔板（高通量）。

发展趋势

1. 数字化ＰＣＲ（ｄＰＣＲ）：

• 将样本分割为微滴，实现**定量无需标准曲线，精度更高。

2. 便携式ｑＰＣＲ仪：

• 现场快速检测（如机场、田间病原体筛查）。

3. 自动化整合：

• 与核酸提取仪、液体处理工作站联用，全流程无人操作。

4. 多重检测升级：

• １６色以上通道，单次检测数十种靶标。

使用注意事项

• 防污染措施：

• 分区操作（试剂准备区→样本处理区→扩增区），使用ＵＮＧ酶防残留污染。

• 质控设置：

• 阴性对照（无模板）、阳性对照、内参基因（如ＧＡＰＤＨ）。

• 熔解曲线验证（ＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ法）：

• 确保扩增产物单一，无非特异峰。

总结

实时荧光定量ＰＣＲ分析仪凭借其高灵敏度、定量准确性和操作便捷性，已成为分子诊断与生命科学研究的基石设备。从新冠疫情中的病毒载量监测，到癌症基因的精准分型，其应用深度持续拓展。随着数字化、便携化与自动化技术的融合，ｑＰＣＲ技术将继续推动精准医疗与即时检测的发展。

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